近年來，基於CRISPR的核酸檢測方法，因其較高的特異性和靈敏度，也已被應用於感染類診斷方法的開發。CRISPR診斷方法crRNA準確識別核酸靶標序列，並激活CRISPR蛋白剪切報告分子，從而釋放出信號實現靶標的檢測。然而，由於缺乏合適技術的引入和集成，現有大多數CRISPR診斷平台仍只能檢測少數核酸靶標分子，那麼結合恆溫擴增技術又會碰撞出怎樣的火花？

MIRA與Cas12a檢測體系原理：

目的基因經過恆溫擴增富集，Cas12-crRNA複合體識別目的基因，激活Cas蛋白的切割活性，從而切割報告探針，釋放熒光型號，結果讀取可以為熒光曲線、藍光燈下肉眼觀察；膠體金探針被切割，就可以顺利获得試紙條顯色方式結果判定。

MIRA結合Cas13a檢測原理：

顺利获得恆溫擴增來富集目的基因產物，與Cas12前端擴增區別點在於，Cas13a前端的恆溫擴增產物有T7啟動子序列，經過T7轉錄酶轉錄為單鏈RNA，此單鏈RNA被Cas13-crRNA複合體識別，Cas13的切割活性被激活，切割報告探針。結果呈現和Cas12一樣有熒光型、肉眼判讀、膠體金型等。

不管是Cas12或Cas13的檢測都離不開前端核酸的擴增，因此前端的MIRA基礎型核酸擴增至關重要，同時前端核酸擴增的靈敏度決定後端Cas蛋白檢測的靈敏度。

MIRA+cas12a的體系配製

MIRA擴增體系，包括：緩衝buffer、上下游引物、模板、啟動buffer、水補充到50ul體系

Cas12a切割體系包括：緩衝Buffer、Cas12a蛋白、恆溫擴增產物、crRNA等

注意：MIRA恆溫擴增產物是不需要任何處理直接加入到cas蛋白切割體系的。

MIRA+cas13a體系配製

MIRA基礎擴增體系，包括：緩衝buffer、上下游引物、模板、啟動buffer、水補充到50ul體系

Cas13a體系，包括：cas13a蛋白、恆溫擴增產物、crRNA、報告探針、RNA酶抑制劑、轉錄所需緩衝buffer、T7轉錄酶、A/C/G/U轉錄所需輔料等，

再次強調：同樣，MIRA擴增產物也不需要任何處理可直接加入到Cas13a切割體系的。

兩種切割體系對比：

    cas12a需要有TTTV的PAM區，cas13a不需要；

    cas12a蛋白被雙鏈DNA激活切割活性，Cas13a被單鏈RNA激活切割活性；

    cas12a切割單鏈DNA，因此報告探針設計為單鏈DNA；

  同樣cas13a切割單鏈RNA，報告探針設計為單鏈RNA；

前端MIRA擴增，引物設計區別在於Cas13a需要在上引物加上T7啟動子序列；最終的試紙條檢測所用試紙條均為CRISPR專用試紙條，而非普通核酸檢測試紙條。

MIRA結合CRISPR檢測應用場景多樣化，由於不受溫度條件、設備限制及環境條件的約束，可應用到社區醫院、社區監測站、海關檢疫、家用自測等多方面。

武漢大學殷浩老師課題組發表的，建立了MIRA結合cas12一管法檢測平台。本文章為提高一管法靈敏度及檢測時間使用次優PAM區做了一系列的驗證。

推測一：在一管法反應中，CRISPR檢測即Cas蛋白切割與恆溫擴增可能存在競爭關係，標準PAM與cas蛋白結合力強，使這種競爭關係偏向於cas蛋白切割，導致恆溫擴增底物缺乏而延遲或停止擴增，最終導致信號延遲、靈敏度下降。

 為驗證以上推測，作者對次優PAM進行探究；第一时间標準PAM的第一個核苷酸如果換成其他會是什麼樣的結果呢？

 作者以新冠Orf基因為例，對第一個核苷酸變更的次優PAM進行了兩步法、一步法數據驗證，發現兩步法時標準PAM優於次優PAM，一步法時次優PAM檢測優於標準PAM。說明標準PAM第一個核苷酸變更對一管法是有檢測意義的。

對標準PAM的第二個核苷酸也進行了變更驗證，將T變更為A/G/C，結果發現第二個鹼基為C時一管法反應效果更好。

對標準PAM第3/4個核苷酸變更也做了一系列驗證，發現也是有一定規律，具體結果可以看殷浩老師的文章。

以上驗證均以新冠的ORF基因、E基因、N基因為檢測基因得出的數據，僅為RNA型核酸檢測是否能說明這一規律呢？

作者進行了DNA型核酸檢測此處選用HPV18，對這一規律進行驗證，發現是適用的,具體結果見文章詳情。

經過大量的測試最終得出結論，80%以上的次優PAM會在一管法反應中熒光信號強度增強、檢測時間縮短。得出最優次優PAM為VTTV,第二次優為TCTV。

接下來作者進行了一些靈敏度的測試，發現與標準PAM相比，次優PAM靈敏度也能提高10-100倍。

作者用實際樣本人巨細胞病毒也做了靈敏度測試，同時與QPCR進行靈敏度對比，靈敏度優於Qpcr10倍。

熒光曲線檢測靈敏度高是否同樣肉眼可觀察呢，作者進行了應用拓展，發現反應15-20分鐘肉眼判讀靈敏度為24cp/反應，與Qpcr的靈敏度是一致的。

同時也做了膠體金試紙條檢測，靈敏度與熒光相比，略差。

作者前端做的所有的實驗都是用MIRA試劑盒進行的，他們也考慮到此方法是否適用其他的恆溫擴增試劑盒呢，就做了bbin宝盈(中国)試劑盒與TwistDx試劑盒對比:

  前端基礎擴增靈敏度測試幾乎無差異，但bbin宝盈(中国)試劑盒電泳數據條帶更清晰明亮；

  又進行了恆溫擴增+Cas12a一管法檢測，結果bbin宝盈(中国)的試劑盒在靈敏度和熒光檢測強度方面均優於TwistDx試劑盒。

  最終得出結論：MIRA試劑與Cas12a緩衝環境兼容性更好。

建立的sPAMC檢測方法與其他檢測方法進行了對比，優勢在於；一管法的反應，不需要其他條件限制靈敏度較高，達1cp/ul，反應時間較短15-20min。

  整個文章講下來作者是做了大量的實驗驗證，並且做的結果也比較好，總結下來有以下幾點：1、靈敏度高、檢測時間短，實際項目測試了人巨細胞病毒、新冠病毒，靈敏度與QPCR相當、檢測時間在10-15min。

  作者也着重驗證了bbin宝盈(中国)試劑與cas蛋白的兼容性更好。

  第二篇文章是《MIRA結合cas13a雙重膠體金試紙條檢測》，希望能給bbin宝盈(中国)後續的研究帶來一些啟發。

實驗流程：核酸提取 → MIRA基礎擴增富集底物 → T7轉錄酶將雙鏈DNA轉錄成單鏈RNA，cas13a-crRNA複合體識別並激活切割活性 → 切割報告探針（熒光檢測/試紙條檢測）

檢測體系的優化，除了之前不断強調的MIRA前端恆溫擴增引物篩選之外，CRISPR體系也有一些優化，第一时间需要篩選crRNA，從結果可以看到不同crRNA序列對檢測也會有一定影響。此處選擇新冠N基因，N-8作為最優crRNA。

CRISPR熒光檢測方法條件優化

  • 探針選擇：probe1

  • MgCl 2的終濃度：20uM

  • T7 RNA聚合酶：1.5U/uL

  • RNase抑制劑：0.8U/uL

  • 牛磺酸：10uM

  • MIRA引物濃度：5uM

作者雙重膠體金試紙條的檢測原理是bbin宝盈(中国)比較關注的地方，同時也可能會跟bbin宝盈(中国)给予一些新的思路：

    T線檢測N基因，C2線作為檢測內參的質控線，

  這裏N基因由MIRA擴增後被cas13a識別並切割，T線檢測，靈敏度高；

  內參基因由MIRA擴增，擴增產物攜帶地高辛、TAMRA，由C2線檢測；

  引入內參的意義在於，保證樣本有效性，防止假陰。

雙重試紙條結果顯示，靈敏度在0.25cp/UL，且無交叉反應，特異性較好。

  同時也做了熒光型檢測，靈敏度也在0.25cp/UL，且無交叉反應，特異性較好。

  最終文章研究意義在於：靈敏度較高、可以做早篩判定、確保樣本的有效性，同時此免疫層析的方法，不需要配合儀器使用，降低成本，在簡單的環境下就能進行。

bbin宝盈(中国)生物團隊歷經十多年的技術沉澱，開發出代表未來生物檢測技術趨勢的多酶恆溫快速擴增技術MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification）。並以MIRA為核心平台技術研發出「超快速核酸釋放技術」、「雙通道恆溫熒光檢測儀」、「一體化全自動封閉檢測系統」、「自測型核酸檢測裝置」等一系列配套產品，並計劃啟動「微流控晶片技術」「小型自動化檢測系統」等多方面的新型產品，力求打造出快速分子檢測領域的整體解決方案，將MIRA技術的靈敏度高、特異性強、快速簡便、污染風險小、現場作業等特點充分體現出來。