【檢測原理】本試劑盒基於一種常溫恆溫核酸快速擴增技術：在常溫恆溫下（一般為 39 ºC~42 ºC），反應體系中的重組酶、單鏈DNA 結合蛋白和DNA聚合酶等利用特異性引物進行快速核酸擴增反應。隨着擴增產物積累，設計的特異性分子探針在核酸外切酶的作用下釋放熒光信號，使用熒光檢測設備能實現對目標片段擴增過程的實時監控。

【主要組成成分】

組成	含量	主要成分
E buffer	1.0ml*2管	反應緩衝液
B buffer	0.15ml*1管	Mg2+等
正對照模板（089）	0.1ml*1管	合成質粒
試劑	48份	酶、dNTPs 等

【儲存條件及有效期】

1. 儲存條件：溫度 ≤ -20 °C 恆溫環境，避光保存，避免重壓；

2. 產品有效期：14 個月；

3. 生產日期見外包裝

【適用儀器】

1. 適用於 Applied Biosystems 7500、QuantStudio 3/5 、 QuantStudio 6/7 Flex等熒光定量 PCR 儀；

2. 適用於我司的 WL-16-III 等恆溫熒光檢測儀。

【樣本要求】

1. 按照相關標準採集樣本；

2. 樣本採集後建議儘快檢測，24 小時內進行檢測樣本可暫時保存於 4 ºC；長時間保存則置於-70℃以下，並避免反覆凍融；

3. 如使用樣本保存液或快速釋放劑等處理樣本，注意影響蛋白活性的物質如酸、鹼鹽、表面活性劑等殘留對試劑性能的影響。

【檢測方法】

1.試劑準備（試劑準備區）

1.1 取出包裝盒中的各組分(凍干試劑除外)，室溫放置，融化後混勻，瞬時離心備用（注意，如未完全融化直接使用可能對實驗效果產生影響）；

1.2 根據待測樣本、陰性和陽性對照的數量準備凍干試劑，每個凍干試劑加入 37.5 μL E buffer。

2.樣本處理（樣本處理區）

2.1 核酸提取：選擇合適的核酸提取方法和試劑提取樣本核酸；

2.2 向反應管中加入 10 μL 核酸模板（模板量可調整，以無菌水補足；即核酸模板加無菌水共 10 μL），陽性對照加入 10 μL 正對照模板，陰性對照加入 10 μL 無菌水；

2.3 每個反應管加入 2.5 μL B buffer, 蓋好管蓋（對於多個反應，建議將 B buffer 加至反應管的蓋子內側）；上下顛倒反應管 8-10次充分混合，混勻後，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，轉移至擴增區。

3.核酸擴增（擴增區）

根據不同的應用需求可以選擇不同的程序

設置方式：

1）程序設置方案一（推薦）：靈敏度高，適用於低濃度樣本檢測，但擴增曲線可能出現非典型 S 形態，不同濃度樣本結果 Ct 無明顯規律；

程序設置方案一結果示例

2）程序設置方案二：操作簡便，低拷貝樣本檢出率低於程序設置方案一。

程序設置方案二結果示例

*註：結果示例僅用於說明兩種程序下熒光曲線差異，實際結果以實驗為準。

3.1 程序設置方案一

3.1.1 程序設置

步驟	溫度	時間	循環數
1.恆溫孵育	39ºC-42ºC	4 min	/
2.熒光檢測	39ºC-42ºC	30 s	30

註：

i 溫度設置推薦 39℃；

ii. 步驟

①為孵育階段，在恆溫金屬浴進行；孵育結束後上下顛倒反應管 8-10 次充分混勻後瞬離，再進入步驟②；

iii. 步驟

②為熒光檢測階段，檢測通道為 FAM，30s/cycle，30 個循環，時長 15 分鐘；

iiii.使用 ABI 系列熒光定量 PCR 儀，請務必於

Passive Reference 和 Quencher 處均選擇「None」;

3.1.2 質量控制

陰性對照 Ct 值 ≥27 或未檢出，陽性對照Ct 值 ≤ 15；同一實驗需同時滿足以上要求，否則本次實驗視為無效。

3.1.3 結果判讀

根據分析後熒光曲線圖像調整檢測通道的基線（Baseline）和閾值（Threshold），基線起始設為 1~2 循環、終止設在本組數據中最小的 CT 值循環處（一般可設置為 2~4），使各項參數符合「3.1.2 質量控制」中的要求，然後進行陰陽性判定：FAM 通道擴增曲線呈指數增長且 Ct<27 為陽性；FAM 通道擴

增曲線無 Ct 值或 Ct≥27 為陰性

3.2 程序設置方案二

3.2.1 程序設置

39℃，FAM 通道 30 秒採集一次熒光信號，設置 40 個循環。

3.2.2 質量控制

陰性對照 Ct 值≥35 或未檢出；陽性對照 Ct值≤ 20；同一實驗需同時滿足以上要求，否則本次實驗視為無效。

3.2.3 結果判讀

根據分析後熒光曲線圖像調整檢測通道的基線（Baseline）和閾值（Threshold），基線起始設為 1~2 循環、終止設在本組數據中最小的 CT 值循環處（一般可設置為 2~6），使各項參數符合「3.2.2 質量控制」中的要求，然後進行陰陽性判定：FAM 通道擴增曲線呈指數增長且 Ct<35 為陽性；FAM 通道擴

增曲線無 Ct 值或 Ct≥35 為陰性。

【檢驗結果的解釋】

1. 樣本採集、運輸、保存不當，試劑運輸、保存、配製不當都可能會影響實驗結果，甚至會導致假陰性結果；

2. 如果實驗室污染、試劑污染、樣品交叉污染，可能出現假陽性結果；

3. 因方法學差異，使用市面上部分品牌的熒光 PCR 儀可能出現熒光曲線異常現象，推薦使用我司設備或 AppliedBiosystems 系列熒光定量 PCR 儀。

【注意事項】

1. 使用前請仔細閱讀說明書，嚴格按照操作步驟進行操作；

2. 樣品處理應該嚴格按照生物安全規範操作，實驗過程中應穿着工作服，戴一次性手套，實驗分區域進行避免交叉污染；

3. 使用有效期內試劑，且各組分不得與其他批號混用，試劑盒各組分使用前室溫充分融化後混勻，短暫離心後使用；

4. 反應管中儘量避免氣泡存在，管蓋蓋緊，反應結束後擴增管置於密封袋內，按要求丟棄處理；

5. 本試劑盒僅用於科研使用，不作為臨床診斷使用。

商品參數