【儲存條件及有效期】

1. 儲存條件：溫度 ≤ -20 °C恆溫環境，避光保存，避免重壓；

2. 產品有效期：14個月；

3. 生產日期見外包裝。

【適用儀器】

1. 適用於Applied Biosystems 7500、

QuantStudio 3/5、QuantStudio 6/7 Flex等熒光定量PCR儀；

1. 適用於我司的WL-16-III等恆溫熒光檢測儀。

【樣本要求】

1. 按照相關標準採集樣本；

2. 樣本採集後建議儘快檢測，24小時內進行檢測樣本可暫時保存於4 ºC；長時間保存則置於-70℃以下，並避免反覆凍融；

3. 如使用樣本保存液或快速釋放劑等處理樣本，注意影響蛋白活性的物質如酸、鹼、鹽、表面活性劑等殘留對試劑性能的影響。

【檢測方法】

1.試劑準備（試劑準備區）

1.1取出包裝盒中的各組分(凍干試劑除外)，室溫放置，融化後混勻，瞬時離心備用（注意，如未完全融化直接使用可能對實驗效果產生影響）；

1.2根據待測樣本、陰性和陽性對照的數量準備凍干試劑，每個凍干試劑加入37.5 μL E buffer。

2.樣本處理（樣本處理區）

2.1核酸提取

選擇合適的核酸提取方法和試劑提取樣本核酸；

2.2向反應管中加入10 μL核酸模板（模板量可調整，以無菌水補足；即核酸模板加無菌水共10 μL），陽性對照加入10 μL正對照模板，陰性對照加入10 μL無菌水；

2.3每個反應管加入2.5 μL B buffer, 蓋好管蓋（對於多個反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側）；上下顛倒反應管8-10次充分混合，混勻後，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，轉移至擴增區。

3.核酸擴增（擴增區）

根據不同的應用需求可以選擇不同的程序設置方式：

1. 程序設置方案一（推薦）：靈敏度高，適用於低濃度樣本檢測，但擴增曲線可能出現非典型S形態，不同濃度樣本結果Ct無明顯規律；

程序設置方案一結果示例

2.  程序設置方案二：操作簡便，低拷貝樣本檢出率低於程序設置方案一。

註：

i 溫度設置推薦39℃；

ii. 步驟①為孵育階段，在恆溫金屬浴進行；孵育結束後上下顛倒反應管8-10次充分混勻後瞬離，再進入步驟②；

iii. 步驟②為熒光檢測階段，檢測通道為FAM，30s/cycle，30個循環，時長15分鐘；

iiii.使用ABI系列熒光定量PCR儀，請務必於Passive Reference和Quencher處均選擇「None」。

3.1.2 質量控制

陰性對照Ct值 ≥27或未檢出，陽性對照Ct值 ≤ 15；同一實驗需同時滿足以上要求，否則本次實驗視為無效。

3.1.3 結果判讀

根據分析後熒光曲線圖像調整檢測通道的基線（Baseline）和閾值（Threshold），基線起始設為1~2循環、終止設在本組數據中最小的CT值循環處（一般可設置為2~4），使各項參數符合「3.1.2質量控制」中的要求，然後進行陰陽性判定：FAM通道擴增曲線呈指數增長且Ct<27為陽性；FAM通道擴增曲線無Ct值或Ct≥27為陰性。

3.2程序設置方案二

3.2.1 程序設置

39℃，FAM通道30秒採集一次熒光信號，設置40個循環。

3.2.2質量控制

陰性對照Ct值≥35或未檢出；陽性對照Ct值≤ 20；同一實驗需同時滿足以上要求，否則本次實驗視為無效。

3.2.3結果判讀

根據分析後熒光曲線圖像調整檢測通道的基線（Baseline）和閾值（Threshold），基線起始設為1~2循環、終止設在本組數據中最小的CT值循環處（一般可設置為2~6），使各項參數符合「3.2.2質量控制」中的要求，然後進行陰陽性判定：FAM通道擴增曲線呈指數增長且Ct<35為陽性；FAM通道擴增曲線無Ct值或Ct≥35為陰性。

【檢驗結果的解釋】

1. 樣本採集、運輸、保存不當，試劑運輸、保存、配製不當都可能會影響實驗結果，甚至會導致假陰性結果；

2. 如果實驗室污染、試劑污染、樣品交叉污染，可能出現假陽性結果；

3. 因方法學差異，使用市面上部分品牌的熒光PCR儀可能出現熒光曲線異常現象，推薦使用我司設備或Applied Biosystems系列熒光定量PCR儀。

【注意事項】

1. 使用前請仔細閱讀說明書，嚴格按照操作步驟進行操作；

2. 樣品處理應該嚴格按照生物安全規範操作，實驗過程中應穿着工作服，戴一次性手套，實驗分區域進行避免交叉污染；

3. 使用有效期內試劑，且各組分不得與其他批號混用，試劑盒各組分使用前室溫充分融化後混勻，短暫離心後使用；

4. 反應管中儘量避免氣泡存在，管蓋蓋緊，反應結束後擴增管置於密封袋內，按要求丟棄處理；

5. 本試劑盒僅用於科研使用，不作為臨床診斷使用。